1. Introduction (Syllabus)

Cours 1 - Introduction
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1. Historique

- Les Egyptiens connaissaient déjà les tumeurs inflammatoires (abcès), kystiques et solides (Papyrus Eber). De plus la momification des corps et les 4 vases kanope témoignent de leur connaissance de l’anatomie.

- Le relais a été pris par les Grecs. L’école d’Hippocrate (460-377) est la plus connue et repose avant tout sur des descriptions cliniques. Sa physiopathologie était basée sur la "théorie des humeurs" sans que n’y apparaisse la notion de "lésion", substrat organique de la maladie.

- Les Perses pratiquent des dissections anatomiques et Avicenne (Ibn Sina) (980-1037) utilisa les cadavres des champs de bataille à des fins scientifiques. Il publia les 4 canons qui furent traduits largement en Europe. René Descartes (1596-1650) préconise de corréler les faits avec les théories dans son Discours de la Méthode.

- L’émergence de l’anatomie pathologique est, avant l’expérimentalisme de Claude Bernard (1813-1878), le premier stade de développement de la médecine moderne. Cette émergence est progressive est s’étend de la moitié du XVIIème à la fin du XIXème siècle.

- La pratique de l’autopsie depuis la renaissance fut longtemps à visée purement anatomique, sans que l’on y retrouve un désir d’étude du processus pathologique ("pathologie"). Hermann Boerhave (1668-1738), médecin à Leyde, fut un des premiers à étudier les cadavres des médecins décédés, pour découvrir la cause de la maladie et de la mort.

- Giovanni-Batista Morgagni (1682-1771), professeur de médecine à Padoue et anatomiste, peut être considéré comme le premier anatomo-pathologiste moderne. Il entreprit d’établir une relation de cause à effet entre les lésions constatées chez le cadavre et la sémiologie clinique. Il fonda à ce titre la "Méthode anatomo-clinique". Contrairement à Boerhave qui ne cherchait dans l’autopsie qu’une confirmation du diagnostic clinique, Morgagni construisit autour de l’anatomie pathologique un véritable système de pensée devant déboucher sur une classification rationnelle des maladies (nosologie). Morgagni publia ainsi en 1761, à Venise, le premier ouvrage d’anatomie pathologique "De sedibus et causis morborum per anatomen indagatis". Morgagni, cependant, ne se livra qu’à une analyse macroscopique des lésions. Il n’utilisa pas le microscope, pourtant utilisé au siècle précédent par Leeuwenhoeck et très vraisemblablement connu de lui.

- La méthode anatomo-clinique connut sa principale expansion à Paris au début du dix-neuvième siècle. L’indépendance d’esprit qui y régnait après la révolution permit l’émergence d’une école originale affranchie des principes d’Hippocrate. Xavier Bichat (1771-1802), chirurgien de l’Hotel-Dieu, reconnait et analyse la notion de "tissus". Dans la lignée de Morgagni, Bichat développe la méthode anatomo-clinique. Selon lui, "Disséquer en anatomie, faire des expériences en physiologie, suivre des malades et ouvrir des cadavres en médecine, c’est là une triple voie hors laquelle il ne peut y avoir d’anatomiste, de physiologiste ou de médecin." Après Bichat, la méthode anatomo-clinique, développée par René Laennec (1781-1826, hôpital Necker-Enfants Malades) permit à l’Ecole Française de Médecine de batir la première étape de l’évolution qui conduisit à la médecine contemporaine.

- Le microscope optique apparut ainsi que l’étude des tissus et des cellules et la théorie cellulaire vit le jour (1839 T. Schwann et M.J. Schleiden à Berlin). La théorie cellulaire trouva un ardent défenseur en R. Virchow (1821-1902) en Allemagne (Berlin) qui l’appliqua à la pathologie et en fit la base de la classification histopathologique des lésions. Les maladies infectieuses furent bien individualisées grâce aux travaux de Louis Pasteur (1822-1895). Cette démarche est encore utilisée de nos jours.

- Depuis les années cinquante, plusieurs avancées technologiques se sont ajoutées à la microscopie traditionnelle : la microscopie électronique, l’histochimie, l’immunohistochimie et la biologie moléculaire. La morphologie n’est plus le seul principe organisateur de la classification nosologique des maladies. Par exemple, la classification des lymphomes prend en compte les données de la cytologie, de l’immunohistochimie, de la cytogénétique et de la biologie moléculaire.

2. La place de l’Anatomie-Cytopathologique dans la médecine moderne

- L’Anatomie Pathologique est l’application aux cellules et aux tissus prélevés chez l’homme de diverses méthodes d’analyse basées principalement sur la morphologie, à des fins de diagnostic, de pronostic et de meilleure compréhension des causes et mécanismes des maladies.

- La démarche anatomopathologique est basée sur une sémiologie diagnostique qui repose sur un raisonnement analogique. Celui ci compare la morphologie des tissus normaux et celle des tissus pathologiques. La variation morphologique entre le Normal et le Pathologique définit la lésion, caractérisée par un ensemble de signes morphologiques.

- La lésion se définit donc comme une altération morphologique décelable par un moyen d’observation quelconque, cause ou conséquence d’un processus morbide. Cette définition exclut les modifications fonctionnelles de l’état normal. Une lésion élémentaire est une unité lésionnelle correspondant à l’altération morphologique d’une structure considérée isolément.

- Les lésions élémentaires s’organisent en un ensemble lésionnel qui permet de formuler un diagnostic. Ces signes sont confrontés aux données cliniques (corrélation anatomo-clinique). L’observation de cas semblables antérieurs, dont l’évolution est connue, permet de donner à cette sémiologie une signification pronostique.

- Les quatre grandes familles lésionnelles sont les malformations, les phénomènes immunitaires et inflammatoires, les troubles circulatoires et les tumeurs. L’investigation et la compréhension des mécanismes impliqués dans les lésions observées sont une des sources de la recherche médicale appliquée. Ainsi, l’anatomie pathologique constitue un carrefour interactif entre la médecine clinique, la biologie médicale et l’imagerie. Un dialogue quotidien avec les cliniciens prescripteurs s’avère indispensable.

3- Place diagnostique (histopathologie et cytopathologie)

3-1- Démarche diagnostique

- Celle-ci suit les mêmes étapes que la démarche clinique. Les renseignements cliniques (sur la feuille de demande d’examen) tiennent lieu d’interrogatoire, la sémiologie des altérations cellulaires et tissulaires est l’équivalent de l’examen physique. Il faut ensuite intégrer l’ensemble des faits observés en un regroupement lésionnel connu ou, plus exactement, un diagnostic.

3-2- Les outils: le microscope

3-2-1- Matériel

- La cytologie étudie les cellules isolées soit à partir d’une cytoponction d’un organe plein (nodule thyroïdien, mammaire, ganglion), soit à partir d’un liquide (pleural, ascite, urines, liquide céphalo-rachidien), soit à partir d’un frottis (FCV). Cet examen peut être indiqué aussi bien à titre préventif dans le cadre d’un dépistage (frottis cervico-vaginaux) qu’à titre diagnostique devant une lésion (ascite, nodule thyroïdien...). La cytologie de dépistage est en première ligne en tant qu’examen non invasif, en particulier la cytologie gynécologique (FCV). Les autres cytologies (respiratoire, urinaire, cytoponction) sont des méthodes diagnostiques devant une maladie déclarée à identifier.

- La biopsie est un prélèvement d’un fragment de tissu sur un être vivant. Elle contribue au diagnostic, qu’elle soit simple ou de type exérèse (pour une petite lésion le plus souvent). Elle permet de différencier des maladies inflammatoires ou de porter un diagnostic de tumeur. Elle peut être faite à la pince (digestive), à l’aiguille fine (cytoponction) ou au punch (dermatologie) ou au bistouri.

- L’examen extemporané est un examen anatomopathologique qui permet de donner un résultat au clinicien en quelques minutes. Il a des indications très précises: il peut être demandé chaque fois que le résultat de cet examen est susceptible de modifier l’acte chirurgical : . détermination de la nature bénigne ou maligne d’une tumeur (ex: tumorectomie pour une lésion bénigne du sein. Mastectomie + curage ganglionnaire pour une lésion maligne) . détermination des limites d’exérèse d’une tumeur . recherche d’une infiltration tumorale métastatique, en particulier ganglionnaire . détermination des limites d’exérèse d’une malformation, comme la maladie de Hirschsprung.

- L’étude de la pièce opératoire consiste en un bilan des lésions (nombre, siège, aspect), de leur extension et, éventuellement en une appréciation des effets thérapeutiques (importance de la nécrose après chimiothérapie).

- L’autopsie est un examen pratiqué sur un corps dans un but scientifique, soit pour rechercher la cause du décès, soit pour une autre cause (conseil génétique en foetopathologie, diagnostic de la maladie de Creutzfeld-Jakob). La demande d’autopsie est le plus souvent effectuée par le médecin traitant, plus rarement par la famille. Lors de cet acte, une médiane sus et sous-ombilicale est réalisée, l’ensemble des organes est examiné et des prélèvements orientés sont effectués. Pour réaliser des prélèvements à but scientifique, plusieurs conditions prévues par la loi n°94-654 du 29 juillet 1994 doivent impérativement être remplies.

En pratique, le médecin hospitalier qui souhaite que soit réalisée une autopsie à visée scientifique doit:
- en faire la demande écrite, signée, datée (en plus du procès verbal du constat de la mort)
- s’assurer de la présomption de consentement de la personne décédée (interrogation du Registre National des Refus, interrogation du Registre du Bureau des Admissions, recueil du témoignage de la famille) (code de la Santé Publique, article L.671-7)
- informer la famille des prélèvements effectués (article L.671-9 du code de la Santé Publique)
- faire contresigner le formulaire de demande par le Directeur de l’Hôpital ou son représentant
- Ces dispositions ne s’appliquent pas dans le cadre des autopsies médico-légales demandées par les autorités judiciaires ou administratives et réalisées par les médecins légistes.

3-2-2- Méthodes

- La macroscopie est un temps très important de l’examen anatomopathologique et consiste en un examen à l’oeil nu, soigneux, des altérations tissulaires. Elle s’appuie sur une bonne connaissance de l’anatomie et des renseignements cliniques corrects. Cette étude permet d’effectuer les prélèvements tissulaires dirigés, bien orientés, adaptés au problème posé. Ces prélèvements feront l’objet d’un examen microscopique. Lors de ce temps macroscopique, selon les indications, des prélèvements peuvent être faits pour la bactériologie, la congélation, la microscopie électronique, la culture cellulaire et la cytogénétique. Des photographies macroscopiques peuvent être réalisées.

- La microscopie optique est l’examen de base avant toute autre technique. Plusieurs étapes sont nécessaires pour permettre l’étude microscopique d’un tissu : . La fixation permet la conservation morphologique des structures tissulaires et cellulaires. Les fixateurs les plus utilisés sont le formol et le liquide de Bouin. Quel que soit le fixateur utilisé, il importe que la fixation soit précoce, avec un volume de fixateur suffisant (au moins 10 fois le volume de la pièce) dans un récipient de taille suffisante pour ne pas déformer le prélèvement. Les organes creux doivent être ouverts. . L’inclusion en bloc de paraffine permet de rigidifier le prélèvement avant sa coupe. . La coupe au microtome permet de réaliser une coupe très fine (6 microns) du prélèvement. Cette finesse permet aux rayons lumineux de traverser le prélèvement et d’éviter les superpositions cellulaires. La coupe est déposée sur une lame en verre. . La coloration permet de colorer spécifiquement les différentes structures tissulaires et cellulaires. Différents colorants sont utilisés : la coloration de base est l’hématéine-éosine (+ safran en France); le trichrome de Masson permet d’étudier les fibres de collagène; le PAS (Périodique Acide-Schiff) colore les molécules glycosylées; la coloration de Perls, le fer; la coloration de Fontana, la mélanine ; le rouge Congo, les substances amyloïdes. . Les lames peuvent ensuite être examinées au microscope en étudiant la transmission d’un rayon lumineux.

- Les coupes à congélation sont des coupes de tissus frais congelés réalisés sur un microtome refroidi à -20°C (cryostat). Après la coupe, les lames sont directement observées après coloration. Cette technique permet la réalisation d’examens extemporanés per-opératoires. En évitant la fixation du tissu et son inclusion en paraffine, elle permet également de conserver l’intégrité des sites antigéniques et des acides nucléiques. Les coupes en congélation sont donc fréquemment utilisés en immunohistochimie et en biologie moléculaire (hybridation in situ).

- La cytologie des liquides (liquide céphalo-rachidien, liquide pleural ou péritonéal), des appositions de tumeurs ou de ganglions et des frottis (frottis cervico-vaginaux) est une technique plus rapide. Les cellules contenus dans le liquide sont projetées sur une lame par centrifugation (cytocentrifugation) puis colorées. Lors d’une apposition, les cellules sont déposées sur une lame en apposant le prélèvement sur une lame.

La cytologie hématologique est séchée à l’air puis colorée par le May-Grunwald-Giemsa (MGG). Les autres cytologies peuvent être colorés par le MGG, par la coloration de Papanicolaou (frottis cervico-vaginaux) ou par d’autres colorations (PAS, Gram, Grocott).

Immunohistochimie: Elle permet de détecter un antigène grâce à un anticorps

spécifique couplé à une enzyme ou à une substance fluorescente. Lorsque l’anticorps est couplé avec une enzyme, celui-ci réagit avec un substrat pour donner une réaction colorée liée à la précipitation d’une substance chromogène, facile à visualiser en microscopie optique.

Une des principales difficultés de l’immunohistochimie est liée à la destruction des antigènes membranaires par les techniques habituelles de fixation. Cette étape de fixation doit être remplacée alors par une congélation du prélèvement dans l’azote liquide et sa conservation dans l’azote liquide ou au congélateur à -80°C. Cependant, de plus en plus d’anticorps reconnaissent des épitopes préservés après la fixation, leur sensibilité permettant l’étude de coupes fixées, incluses en paraffine. Les anticorps les plus usuels sont les anticorps polyclonaux de lapin et les anticorps monoclonaux de souris. Leur application diagnostique est quotidienne. Ils permettent par exemple de typer une population lymphoïde dans une prolifération lymphomateuse ou de caractériser la différenciation d’une tumeur en étudiant les filaments intermédiaires du cytosquelette.

- L’immunofluorescence détecte électivement les dépôts extracellulaires et est d’usage quotidien en dermatologie et en néphrologie.

- Microscopie électronique: celle-ci nécessite une fixation spéciale (glutaraldéhyde) et une inclusion spéciale (résine epoxy). Elle doit donc être prévue et organisée. Les indications à des fins diagnostiques sont limitées (anomalies des cils bronchiques, maladies héréditaires des membranes basales de la peau et du glomérule rénal, par exemple). Par contre, l’étude ultrastructurale garde son intérêt en recherche.

- Biologie moléculaire: la biologie moléculaire est encore une technique de recherche. Il existe cependant quelques applications diagnostiques en routine:
- l’hybridation in situ (HIS) sur coupes tissulaires permet la détection du génome du virus d’Epstein-Barr (EBV) dans les proliférations lymphoïdes (sonde EBER).
- l’étude du remaniement des gènes d’immunoglobulines et du récepteur T permet d’étudier la clonalité d’une population lymphoïde.
- dans certaines tumeurs, une translocation chromosomique spécifique peut être détectée par une méthode d’amplification génique cyclique (PCR).
- Les fixateurs usuels (et en particulier le liquide de Bouin) dégradent les acides nucléiques. Comme dans le cas de l’immunohistochimie, il est donc nécessaire de congeler des prélèvements si l’on souhaite réaliser ultérieurement une étude de biologie moléculaire, en particulier en pathologie hématologique ou oncologique.

3-3- Les résultats

- Le compte-rendu comporte l’identification du malade (numérique et nominale), un descriptif et une conclusion. Cette dernière est un diagnostic daté et signé. Le compte-rendu est adressé au médecin traitant du malade et est couvert par le secret médical. Une confrontation avec le médecin prescripteur permet de discuter du cas et d’affiner la réponse (confrontation anatomo-clinique).

- Aspect médico-légal: l’anatomo-pathologiste porte des diagnostics par écrit et les signe avec le nom du malade. Il travaille donc de concert avec les autres médecins dans le cadre du secret médical partagé.

- L’informatisation des comptes-rendus combinée aux possibilités d’interrogation à distance nécessite la création de codes d’accès. L’indépendance des anatomo-pathologistes garantit la valeur de contrôle et de confirmation diagnostique des examens qu’ils font.

- Les documents sont archivés et peuvent être consultés, transmis pour contre-expertise ou repris soit pour une analyse rétrospective, soit pour appliquer de nouvelles techniques. Les blocs et les lames sont conservés au moins 10 ans, les comptes-rendus au moins 30 ans.

4- But d’investigation et de recherche des causes des maladies

- La morphologie est un apport très important à la recherche. Le matériel d’étude est le même, mais les outils diffèrent. Les outils de recherche d’aujourd’hui seront pour certains les méthodes de diagnostic de demain.

- Le matériel conservé sous forme de blocs d’inclusion en paraffine ou de prélèvements congelés et stockés à moins 80°C est mis à la disposition des équipes de recherche et permet la réalisation de travaux rétrospectifs.

4-1- Identification des causes des maladies

- L’anatomie pathologique contribue à la mise en évidence d’un agent pathogène. On désigne par le terme d’agent pathogène tout facteur capable d’engendrer une lésion ou de déclencher un processus morbide. Il existe des agents pathogènes exogènes et endogènes.

- Les agents pathogènes sont d’ordre physique (traumatisme, chaleur, froid, rayonnement), chimiques (caustique, toxique, agents inertes (amiante, silice)) ou biologiques (virus, bactéries, parasites). Ils peuvent également être endogènes (métabolites).

- Leur mise en évidence nécessite souvent des techniques complémentaires (colorations spéciales, immunohistochimie), la coopération avec les autres spécialités médicales (parasitologie, bactériologie, virologie). La corrélation des résultats aboutit à l’affinement de la sémiologie diagnostique.

4-2- Identification des mécanismes des maladies

- Mécanismes immunitaires : Les outils de recherche permettent l’étude des médiateurs de l’inflammation ou les molécules d’adhérence cellulaire (système d’adressage des cellules).

- Mécanismes de la carcinogenèse : la morphologie permet de donner une base nosologique aux études de biologie moléculaire, d’étudier in situ l’expression d’un oncogène ou d’un gène suppresseur de tumeur, d’étudier l’expression cellulaire (phénotype) d’une anomalie moléculaire (génotype). L’expression aberrante d’un antigène ou d’un oncogène peut également devenir un marqueur soit diagnostique, soit pronostique.

- Pour mener à bien ces investigations, l’anatomo-pathologiste coopère avec des groupes de recherche sur les différents thèmes de la pathologie humaine: corrélation entre phénotypes lésionnels et données de la génétique moléculaire dans les maladies héréditaires, étude des modèles animaux qui tentent de reproduire les maladies humaines, etc..

4-3- Méthodes utilisées

- L’immunohistochimie continue à se développer au rythme des nouveaux anticorps créés par la recherche ; (l’immunochimie ultrastructurale permet de préciser à l’échelle ultrastructurale la localisation d’un traceur spécifique).

- La génétique : le caryotype constitutionnel ou tumoral et l’hybridation in situ permettent de détecter des anomalies chromosomiques : délétion, duplicatio, amplification (répétitive ou double minute), translocations.

- La biologie moléculaire s’est adaptée à l’étude morphologique avec l’apparition de l’hybridation in situ sur coupes de tissu. Elle permet de détecter des séquences d’ARNm et d’ADN. Les techniques d’amplification: PCR et RT-PCR s’appliquent aux coupes de tissu et permettent une grande sensibilité. Il faut distinguer les anomalies constitutionnelles (facteurs favorisants) des anomalies acquises qui sont utilisées soit comme des marqueurs tumoraux (ex : translocations des lymphomes et tumeurs conjonctives, soit comme des facteurs pronostiques (ex : N-myc des neuroblastomes).

- La microscopie confocale permet une numérisation de l’image fluorescente captée au sein d’une section épaisse de tissu. Elle restitue une image en trois dimensions du tissu ou de la cellule.

- L’analyse d’image permet une approche quantitative des lésions (volume d’une structure, importance de la fibrose, etc..).

- La cytométrie de flux analyse, à grande vitesse, plusieurs paramètres caractéristiques d’une population de cellules en suspension (nombre, volume différents, marqueurs conjugués à un fluorochrome).

- L’automatisation de plus en plus poussée de la discipline due au développement de l’informatique est en cours. Celle-ci touche tout autant la chaîne technique que les méthodes d’archivage et de transmission des comptes-rendus.

Conclusion

Les méthodes utilisant la morphologie comme un marqueur resteront d’une grande aide au diagnostic médical. Ces méthodes d’analyse d’image deviennent plus complexes au fil du temps et demandent une mise à jour permanente des connaissances. L’intégration des données dans un but de diagnostic et de compréhension reste un exercice de synthèse, fruit de l’apprentissage et de l’expérience. Le dynamisme des médecins choisissant cette spécialité médicale et leur capacité d’adaptation et d’assimilation des techniques nouvelles permettront une évolution favorable de la discipline.

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