1	Introduction au diagnostic moléculaire Dr Luc Laurier OLIGNY Pediatric pathologist CHU Sainte-Justine Université de Montréal luc_oligny@ssss.gouv.qc.ca
2	Biologie Moléculaire = Génétique Moléculaire Identification de gènes Manipulation de gènes Identification de mutations Séquençage de gènes Synthèse de gènes
3	Perspectives d’avenir Génome humain: Environ 20 000 gènes Quelques milliers de maladies génétiques connues HUGO (Human Genome Organization): Essentiellement tous les gènes furent séquencés avant 2005 Encore plusieurs polymorphismes restent à caractériser
4	Purification de l’ADN Solution de 10 00 cellules ↓ Lyse Solution de membranes cellulaires, de protéines et d’ADN ↓ Purification de l’ADN Solution d’ADN presque pure
5	Enzyme de restriction : Reconnaît une séquence très précise Ne coupe que cette séquence
6	Enzymes de restriction : Coupent l’ADN à des endroits très précis: e.g. EcoR1 : XXXGAATTCXX XXXG AATTCXX XXXCTTAAGXX XXXCTTAA GXX
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8	Enzymes de restriction Reconnaissent une séquence de 4 à 12 paires de bases 4 bases → 1 coupure par 256 paires de bases (4⁴) 6 bases → 1 coupure par 4 096 PBs (4⁶) 8 bases → 1 coupure par 65 536 PBs (4⁸)
9	Enzyme de restriction
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12	Enzymes de restriction Génome humain (10 000 cellules)
13	Technique de Southern
14	Technique de Southern Digestion de l’ADN Solution d’ADN purifiée (des 10 000 cellules) ↓ Enzymes de restriction 3000 à 3 000 000 de fragments de restriction, 10 000 copies par fragment
15	Technique de Southern
16	Southern - agarose
17	Southern - électrophorèse
18	Southern Membrane de nitrocellulose appliquée sur le gel d’agarose
19	Southern Brins d’ADN absorbés par la membrane: manipulation facile expériences multiples
20	ARN A-U G-C
21	Hybridation de l’ADN A-T-G-C-T-A-C-G-C-C-T-A-C T-A-C-G-A-T-G-C-G-G-A-T-G
22	Hybridation de l’ADN Dénaturation : A-T-G-C-A-C-G-C-C-T-A-C T-A-C-G-T-G-C-G-G-A-T-G
23	Hybridation de l’ADN Sonde en excès : A-T-G-C-T-A-C-G-C-C-T-A-C T-A-C-G-A-T-G-C-G-G-A-T-G T-A-C-G-A-T-G-C-G-G-A-T-G T-A-C-G-A-T-G-C-G-G-A-T-G T-A-C-G-A-T-G-C-C-G-A-T-G
24	Hybridation de l’ADN Renaturation (hybridation) : A-T-G-C-T-A-C-G-C-C-T-A-C T-A-C-G-A-T-G-C-G-G-A-T-G T-A-C-G-A-T-G-C-C-G-A-T-G
25	Hybridation de l’ADN Lavage : A-T-G-C-T-A-C-G-C-C-T-A-C T-A-C-G-A-T-G-C-G-G-A-T-G T-A-C-G-A-T-G-C-G-G-A-T-G
26	Hybridation de l’ADN Mise en évidence de la sonde :
27	Southern : hybridation sur membrane
28	Southern - Dx prénatal
29	Hybridation – principe de base 5’ NNNATGCATGCATGCNNN 3’ 3’ NNNTACGTACGTACGNNN 5’ hybridation 5’ NNNATGCATGCATGCNNN 3’ 3’ TACGTGCGTACG 5’ Stringence Vs Permissivité: Conditions stringentes empêchent l’appariement d’une sonde de 15 à 50 pb même lorsqu’un seul nucléotide est mal apparié
30	Hybridation – principe de base 5’ NNNATGCATGCATGCNNN 3’ 3’ NNNTACGTACGTACGNNN 5’ 5’ NNNATGCATGCATGCNNN 3’ 3’ TACGTACGTACG 5’
31	Technique de Southern Chaque fragment de restriction a une charge et un poids différents de ceux des autres fragments: Migration de l’ADN digéré par électrophorèse sur un gel d’agarose
32	Technique de Southern Chaque fragment de restriction a une charge et un poids différents de ceux des autres fragments: Migration de l’ADN digéré par électrophorèse sur un gel d’agarose Transfert de l’ADN migré sur une autre membrane
33	Technique de Southern Chaque fragment de restriction a une charge et un poids différents de ceux des autres fragments: Migration de l’ADN digéré par électrophorèse sur un gel d’agarose Transfert de l’ADN migré sur une autre membrane Hybridation de l’ADN sur une membrane avec des sondes radioactives
34	Technique de Southern Chaque fragment de restriction a une charge et un poids différents de ceux des autres fragments: Migration de l’ADN digéré par électrophorèse sur un gel d’agarose Transfert de l’ADN migré sur une autre membrane Hybridation de l’ADN sur une membrane avec des sondes radioactives Identification des séquences d’intérêt avec film radiographique
35	Southern - applications Détection de polymorphismes de longueurs d’allèles Utile en diagnostique prénatal, lorsqu’on connaît la longueur de l’allèle muté (ou des allèles mutés) et la longueur des allèles des parents Exactement le même principe que les RFLP
36	Southern - inconvénients Manipulations multiples: $$$ Plusieurs jours requis, même en urgence Grande quantité d’ADN nécessaire Techniques sur micro-échantillons impossibles
37	Enzymes de restriction Chromosome 1: Pat Mat Génome humain: 3,5x10⁹ pb → 3x10³ à 3x10⁶ coupures Tous les fragments de restriction provenant du même allèle sont identiques ( et tous identiques, millions de copies de chacun de ces fragments de restriction)
38	RFLP – sonde reconnaissant un seul allèle polymorphe
39	Southern - applications Perte d’hétérozygotie en oncologie
40	Southern – mutation impliquant un site de restriction
41	Southern quantitatif
42	Southern – Allele Specific Oligonucleotide 5’ NNNATGCATGCATGCNNN 3’ 3’ NNNTCGGTACGTACGNNN 5’ hybridation 5’ NNNATGCATGCATGCNNN 3’ 3’ TACGTACGTACG 5’ Sondes reconnaissant soit l’allèle normal, soit l’allèle muté
43	Southern - ASO 5’ NNNATGCATGCATGCNNN 3’ 3’ NNNTCGGTACGTACGNNN 5’ 5’ NNNATGCATGCATGCNNN 3’ 3’ TACGTACGTACG 5’ 5’ NNNATGCATGCATGCNNN 3’ 3’ TACGTACGTACG 5’
44	Southern - RFLP Sondes connues comme reconnaissant des séquences très polymorphes Statistiquement, deux individus ne peuvent avoir les mêmes longueurs d’allèles pour toutes ces séquences
45	Southern - RFLP Digestion d’ADN par enzyme(s) de restriction Migration (électrophorèse) – Transfert sur membrane Hybridation avec plusieurs sondes, chacune reconnaissant des allèles très polymorphes quant à leur taille Allèles contenant des séquences répétées, dont le nombre de répétitions est très variable au sein de la population
46	RFLP – plusieurs sondes reconnaissant plusieurs allèles polymorphes Mère Enfant ?Père-1 ?Père-2 ?Père-3
47	Hybridation sur tache («dot blot») Avantages sur Southern Digestion non-nécessaire Électrophorèse non-nécessaire Transfert sur membrane non-nécessaire 100 à 10 000 tests par technique Maximum d’environ 30 à 50 avec Southern
48	Hybridation sur tache Les échantillons A1, E3, D9, H7 et H12 sont positifs pour le gène reconnu par la sonde: e.g., VIH
49	Technique de Northern Très semblable à la technique de Southern, mais étudie l’ARN (gènes transcrits) plutôt que l’ADN (gènes / allèles présents)
50	Technique de Northern Semblable à la technique de Southern, mais on utilise l’ARN cellulaire plutôt que l’ADN ARN extrait Pas de digestion ARN séparé par électrophorèse Sonde sur nitrocellulose Techniquement plus difficile que le Southern
51	Technique de Western Électrophorèse de protéines
52	Technique de Western On fait migrer les protéines sur un buvard sous l’action d’électrophorèse, Les petites protéines et les plus anioniques migrent le plus vite vers la charge positive (on choisit le pH de la solution pour favoriser la détection de la protéine qui nous intéresse)
53	Technique de Western Une fois la migration terminée, on identifie la présence de protéine avec des anticorps. Aucun signal: pas de protéine 2 signaux: 2 allèles différents (polymorphisme) ou 2 protéines similaires
54	Amplification de l’ADN in vitro La technique de PCR
55	PCR Très petite quantité d’ADN génomique (une ou quelques cellules) Très grande quantité de la séquence d’ADN recherchée
56	PCR - dénaturation et hybridation
57	Amorces pour PCR Généralement de 10 à 20 pb de long Généralement des séquences uniques dans le génome 2 amorces requises pour le PCR: Une de chaque côté (5’ et 3’) de la région à amplifier
58	PCR TGCCAATGCTTCAATCCGGTAATGACTCGA ACGGTTACGAAGTTAGGCCATTACTGAGC dénaturation TGCCAATGCTTCAATCCGGTAATGACTCGA TGCCAATGCTTCAATCCGGTAATGACTCGA ACGGT TGCCAATGCTTCAATCCGGTAATGACTCGA ACGGTTACGAAGTTAGGCCATTACTGAGCT
59	PCR - Polymérase Synthèse d’ADN à partir du couple d’amorces
60	PCR - 2ème cycle de PCR À la fin du 2ème cycle, nous avons 4 copies de la région comprise entre les 2 amorces
61	PCR - 3ème cycle * À la fin du 3ème cycle, nous avons 6 fragments de même longueur
62	PCR - facteur d’amplification Nombre de copies du gène amplifié +/- (2) ^{nombre de cycles} Nombre de cycles nombre de copies 10 512 15 32 768 20 1 000 000 25 33 000 000
63	PCR - contaminants Les contaminants aussi sont amplifiés: e.g., un laboratoire spécialisé dans la détection de virus amplifie ce virus des millions de fois à chaque jour. Si des instruments ou des solutions sont contaminés avec l’ADN de ce virus, alors tous les échantillons étudiés par PCR seront interprétés comme étant infectés.
64	RT-PCR PCR à partir d’ARN Identique à PCR à partir d’ADN sauf Digestion de tout l’ADN du spécimen Création de cDNA à partir de la mRNA Transcrpitase inverse (Reverse Transcriptase)
65	RT-PCR PCR à partir de l’ARN: L’ADN produit est du cDNA: ADN codant, sans itrons ADN génomique possède exons et introns
66	RT-PCR PCR à partir d’ARN: Ne décèle que les gènes trancrits (ARNm) (comme le Northern)
67	DNA Microarray Micropuces d’ADN
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73	EXEMPLES D’APPLICATIONS
74	Applications Microbiologie
75	Diagnostique moléculaire Applications Microbiologie: Évite cultures Bactérie : 2-3 jours Mycobactérie (tuberculose) : 6 à 12 semaines Virus : difficiles, fastidieuses et coûteuses PCR requiert moins de 6 heures (si urgent) Permet aussi l’identification de gènes de résistance aux antibiotiques
76	Applications Virologie: Hybridation in situ sur sections histologiques Virus du Papillome Humain (HPV) Cytomégalovirus (CMV) PCR Virus Epstein-Barr (EBV) N’importe quel autre virus Il suffit d’avoir les amorces pour faire le diagnostic
77	Diagnostique moléculaire Applications Médecine légale: RFLP : quelques ng d’ADN permettent d’incriminer ou d’éliminer un suspect Meurtre, sperme, sang, cheveu (au singulier !) O.J. ... (C.S.I.) Paternité
78	APPLICATIONS ONCOLOGIE
79	Diagnostique moléculaire Applications Oncologie Évaluation de la clonalité des tumeurs ?? Lymphome Vs Hyperplasie réactionnelle
80	Diagnostique moléculaire Applications Oncologie Identification de porteurs de mutations germinales P53 (Li-Fraumeni) BRCA1 (sein, ovaire) etc
81	Diagnostique moléculaire Applications Oncologie Pronostic et traitement: Certaines mutations associées à un comportement plus agressif N-MYC amplifié dans neuroblastomes Tx plus agressif Expression du gène MDR (Multi Drug Resistance) - pharmacogénétique
82	Diagnostic moléculaire cDNA et ADN génomique Enzymes de restriction RFLP ASO Concepts essentiels
83	Diagnostic moléculaire Techniques Southern « Dot Blot » ou Hybridation sur tache Northern Western PCR RT-PCR Utilité, Forces et Faiblesses de chacun de ces tests
84	Mes questions d’examen Faciles et pratiques si vous avez compris
85	Examen – type de questions Épidémie hypothétique, causée par 2 virus différents: Symptômes semblables Évolution rapide Séquence d’ADN des 2 organismes connue Tx différents Meilleure modalité diagnostique? Justifiez